超低温保存技术在果树种质资源保存中的应用及国内外研究进展
摘要：超低温保存是作物种质资源离体保存的有效方法之一。本文概述了超低温保存技术在果树种质资源保存中的应用及国内外研究进展，对存在的问题进行了分析，并对其发展提出了建议。
关键词：果树;种质资源;离体保存
植物种质超低温保存是指在低于-196℃的低温条件下对植物器官、组织或细胞进行保存。在这样的低温条件下，植物材料的代谢和生长活动几乎完全停止，因此，能够有效保持材料的遗传稳定性，同时又不会丧失其形态发生的潜能。所以，这是一种不需要继代的长期保存植物种质的，也是果树品种改良和分子遗传学研究的前提和基础。
随着现代果品业的发展，种质资源的重要性越来越被重视。1968年Quatran成功地保存了亚麻细胞，拉开了植物冰冻保存的帷幕。1973年Nag和Street超低温保存胡萝卜悬浮细胞获得成这是植物种质超低温保存的首次报道，之后超低温保存技术在植物种质保存方面的研究和应用逐渐深入。
将超低温保存技术与组织培养技术相结合，可以将大量的果树种质储存在液氮罐中。这种保存形式的优点是果树的种质保存不受土地、人力等条件的限制且取材方便、效率高、极大地节省开支;此外，还可以避免种质保存过程中的自然变异，保证种质的遗传稳定性，同时有利于种质在国际间的交换。
1、材料的选择
由于植物的基因型、抗冻性以及器官、组织和细胞的年龄、生理状态等因素对超低温保存效果有较大的影响，从而要求在整个保存处理过程中采取相应的符合其材料特性的各种措施。不同基因型的植物材料对超低温保存的反应各不相同，冻后存活率的显著差异不仅存在于种间，也存 在于不同品系间。赵艳华等(1998)在包埋干燥超低温保存苹果离体茎尖时发现，材料的生理状态对茎尖存活率的影响甚至比保存过程中处理 因素的影响更大。因此， 在进行超低温保存前，对材料的选择十分重要。可以进行超低温保存的材 料种类很多，主要分为4类：①茎尖和侧生分生组织;②原生质体;③悬浮培养物、愈伤组织和 体细胞胚;④其他植物器官，如胚、子房、花粉、 花药、种子等。
2、超低温保存种质资源的研究进展
2.1 超低温保存技术在苹果和梨中的研究进展 邵建柱(2003)[11] 对苹果等果树种质资源的 离体保存进行了研究，通过对试管苗状态的调整、外植体类型及大小的选择，结合密闭减少氧气供应和水分蒸发，成功地建立了适合苹果等果树离体材料的常温缓慢生长法保存技术。确定了15个梨品种离体茎段培养物的通用继代培养基，即MT+1.0mg/LBA+0.1mg/LNAA+2.0mg/LGA3，为梨的离体保存研究初步奠定了基础。同时还完善了苹果和梨离体茎段的常低温保存技术，使得苹果和梨离体茎段在(3±0.5)℃条件下，保存28个月和24个月后，仍保持近100%存活率。进一步完善了苹果茎段的超低温保存技术，确立了甘油和ABA在预处理中的重要作用。
以苹果离体茎尖为试材，对苹果离体茎尖超低温保存方法比较发现，包埋干燥法操作程序简单，存活率及再生率高，为**的保存方法。
2.2超低温保存技术在枇杷中的研究进展
采用干冻化法对枇杷花粉超低温 保存进行了研究。结果表明：花粉的含水量是决定枇杷花粉超低温保存成败的关键因素， 30%左右的含水量能够保证超低温保存后花粉的活力;解冻温度及方式对超低温保存后花粉的存活力没有明显影响。
对经过干燥脱水至不同含 水量的枇杷离体花粉进行了超低温(-196℃)保存试验。结果表明：超低温保存花粉时，花粉的含水量多寡是成败的关键。对于枇杷而言，选择含水量为13%左右的花粉比较合适。花粉在液氮 中保存2、8h和24h，其发芽率无显著差异。
2.3 超低温保存技术在百合中的研究进展
对百合茎尖玻璃化超低温保存基本条件进行了研究，发现前处理和解冻方 式是影响超低温保存存活率的主要因素。
以百合试管苗茎尖分生组织为材料，对玻璃化法超低温保存技术进行了实验研究，并通过正交设计试验对影响超低温保存存活率的主要影响因素(预培养基中蔗糖浓度、预培养时间和PVS2处理时间)进行了分析，初步建立了百合种质超低温保存的**技术方案。
2.4 超低温保存技术在樱桃中的研究进展
樱桃种质资源的离体保存研究起步较晚，目前尚未见大规模离体保存库建立的报道。Marthe对两个樱桃的中间砧进行过液氮超低温保存研究。Niino采用PVS2玻璃化液对5个甜樱桃品种和2个樱桃砧木进行超低温保存，试验中所使用的玻璃化液中DMSO对材料具有毒害作用，高含量的蔗糖又会加剧材料的褐化，导致保存后 茎尖再生困难。赵艳华等(1999)对马哈利樱桃的超低温保存研究发现PVS3的效果**。 牛爱国在MS培养基中添加10g/L甘露醇可使试管苗保存7.5个月，母株存活率62%，继代后成 活率83%。
2.5 超低温保存技术在其它植物中的研究进展
液氮罐
以离体培养的栗子茎尖为 材料，对超低温保存过程中的影响因素进行研究， 所有基因型的材料均获得再生植株，有的高达38%～54%，建立了有效的超低温保存程序。
对木瓜的超低温保存技术进行了研究，建立了高效率的超低温保存的玻璃化程序：即在含有0.09mol/L蔗糖的MS培养基上继代培养45～50d，然后转移至2.0mol/L丙 三醇+0.4mol/L蔗糖的培养基中， 25℃下包埋处理60min;然后转移至PVS2中， 0℃脱水处理80min，然后迅速投入液氮中，经过解冻处理获得90%的再生率，是一种高效的超低温保存木瓜方法。
采用玻璃化法对草莓茎尖的离体超低温保存进行了初步研究。研究表明，预培养12d的茎尖存活率最高，为82.4%;其次 为6d， 为77.8%;不经预培养的最差，为15.8%。不同品种的成活率和成苗率有差异，宝交早生的 成活率高于UC5，而宝交早生成活茎尖的成苗率(79%)低于UC5(100%)。
首次采用玻璃化法对荔枝 胚性悬浮细胞进行超低温保存。适宜的保存程序为：取换液后3～5d的胚性悬浮细胞→0.4mol/L的山梨醇液中预培养2d→室温下60%PVS2预处理15min→0℃下PVS2处理15～20min→迅速投入液氮→40℃水浴快速化冻→1.2mol/L蔗糖+MS基本培养基洗涤→TTC检测和恢复生长。TTC检测保存细胞的相对存活率高达27.1%。
3、超低温保存中存在问题
3.1 冰冻保护剂
目前使用的冰冻保护剂种类很多，按其是否 能渗透到细胞内，可将冰冻保护剂分为两类：一是渗透性冰冻保护剂，包括二甲基亚砜、甘油、乙二 醇、 丙二醇、乙酰胺等，此类冰冻保护剂多数为低分子中性物质，在溶液中易结合水分子发生水合作用， 使溶液的粘性增加，弱化了水的结晶过程，从而起到了保护效果;二是非渗透性冰冻保护剂，包括蔗糖、葡萄糖、聚乙二醇等，这类物质能溶于水，但不能进入细胞，它能使溶液呈过冷状态，从而起到保护作用。
发现海藻糖能与磷脂相互作用而稳定细胞膜结构，防止冰冻对细胞膜造成直接损伤， 因而它也被用作冰冻保护剂。Bhandal等用海藻糖作唯一的冰冻保护剂， 成功地保存了胡萝卜、烟草等细胞培养物。另外，脯氨酸也可作为冰冻保护剂起到稳定冻存细胞中蛋白质结构的效果。 实验发现，单独使用一种冰冻保护剂，其保存效果并不理想，近几年来，国内外许多研究都在尝试采用复合冰冻保护剂。复合冰冻保护剂的 优越性在于它能充分发挥各种成分的保护作用， 从而产生累加效应。10%或5%二甲基亚砜(DMSO)配合一定浓度的甘油或糖，能显著提高超低温保存后的成活率，而其中糖的种类也因保存材料不同而异。
作为冰冻保护剂应具备以下3个特性：易溶 于水;在适当的浓度范围内是无毒的;化冻后易从保存材料中清除。另外， 冰冻保护剂处理应在低温下进行，而且处理时间不宜过长，一般为20～120min。如桑芽用0.5mol/L山梨糖醇液浸渍过夜，再用10%DMSO与0.5mol/L山梨糖醇液浸渍处理20min，能显著提高超低温保存后的 成活率。
3.2 再生植株的遗传性状和表型特征的变化
对超低温保存木瓜的基因 型和表观遗传变化的研究发现，经过超低温处理 的再生植株， DNA的甲基化修饰最高达6.62%，并检测到了相应目的条带。
对超低温保存的金丝桃再生植株的遗传和生化特征进行分析研究，结果表明处理植株的再生率和染色体数目均具有稳定性，仅在非编码序列存在微量的突变。
有研究发现，经过低温处理的人参在产量方 面未发生变化;超低温保存的紫锦苏组培植株，同对照具有相同的生长速率和产品特性。
3.3 超低温保存中超微结构的变化
研究表明：预培养降低了细 胞的液泡化程度，线粒体嵴变得更为发达，同时细胞的代谢活性增加，而未经预培养的细胞冻后很 难存活。保护剂处理为超低温保存的关键环节，但保护剂处理可造成细胞损伤，从超微结构上 看引起核周隙扩张、膜囊泡化及细胞骨架的塌陷。
在对香蕉茎尖进行超低温保存的过程中，Heliot等(2003)对保存材料在各个步骤的超微结构变化进行了连续观察， 结果表明无论在冷冻/解冻步骤还是冷冻保护剂处理期间，大部分分生组织细胞都受到损伤，仅位于分生组织圆顶周边极小范围内的细胞存活下来。
液氮罐
4、展望
种质资源是产业安全和可持续发展的战略资 源，世界各国十分重视种质资源的收集和创新利 用。目前我国果树种质资源保存的主要手段是圃地保存和组培保存，圃地保存占地大、管理费时费工，并且受到气候条件、病虫害等威胁;组培保存存在着易感染、费工费电、杂合个体性状容易退化、生活力下降等缺点。
超低温冷冻离体保存能够弥补以上不足，该方法建立在生物细胞冻害和抗冻机理的基础上。种质超低温保存成功的关键在于降温冰冻过程中避免细胞内结冰，为此，针对不同种类的植物材料，筛选适合的冰冻保护剂，采用适当的降温冰冻速度和化冻方式，可使细胞不受损伤或使损伤减 小到最低程度。目前的研究表明， 影响植物材料超低温保存效果的因素很多，不同的植物或同一 植物的不同材料类型，其保存的难易和效果均不同。因此，要根据材料本身的特性，对影响保存的因素进行研究，寻找提高超低温保存成活率和再生率的有效途径和方法，从而达到成功保存种质资源的目的。
目前，超低温保存技术的研究大多停留在方法上，供试种质材料的保存时间短，少有长期保存再生情况的报道，对离体种质保存过程中遗传稳定性的研究也很少，研究对象范围狭窄，而且对同一物种不同品种的研究结果也不尽一致。因此，今后的研究方向一是重点选择需优先保护的濒危 物种， 用已成熟的技术进行较大规模的中长期保存及遗传稳定性试验，探讨超低温保存的实际应用效果;二是对已经建立完善再生体系且在生产上具有重要经济价值的果树， 例如樱桃、核桃、板栗、梨、枣、蓝莓等，探索安全简便、长期稳定的超低温保存技术体系。
