经国家食品药品监督管理局批准，由生物制品检定所沈琦所长带队，细胞室主任袁宝珠和副主任孟淑芳组成的考察团，于2012年4月18日至4月27日，分别参观考察了日本JCRB(Japanese Collection of Research Bioresources)细胞库和英国干细胞库(UK Stem Cell Bank，UKSCB)，并与相关机构的管理及研究人员进行了深入交流。
液氮罐
未来数年内，中国食品药品检定研究院将在现生物制品检定所细胞室的基础上，建立具有国际水平的细胞资源收藏及研究中心。此次参观考察的主要目的，是学习国际上著名的细胞资源中心，在建设、管理、使用、细胞质量控制，以及相关课题研究等诸多方面的知识和经验，为建设服务于我国生物制品及药品研发，和各类细胞产品质量控制的国家级细胞资源收藏及研究中心，收集重要明确的信息。同时，以此为契机，与国际上先进的细胞资源中心初步建立良好的合作关系。
一、日本JCRB细胞库
JCRB细胞库位于大阪市郊，隶属于国立生物医学创新研究所(National Institute for Biomedical Innovation, NIBIO)。JCRB细胞库与位于东京的Riken生物资源细胞中心，并列为日本两个最著名的细胞资源中心。JCRB成立于1984，曾经隶属于日本国立卫生研究院(NIHS), 2005年前后，随着新NIBIO研究所在大阪郊区成立，JCRB归属于NIBIO。JCRB细胞库的主要职能是：收集各种研究用细胞株(以人源细胞株为主)，并对所收集的细胞株进行质量控制检测，再结合现代生物及电子信息学技术，整理、收集、建立和管理所收集细胞的相关信息。同时JCRB细胞库向细胞用户(主要是日本国内的生物医药研发机构)分发所收藏的细胞和相关信息，并为细胞用户提供细胞质控相关的服务。JCRB细胞库现已收藏了三千多株细胞，其中绝大多数为人源细胞，包括人源肿瘤细胞，非肿瘤细胞和稀有疾病细胞，以及人源胚胎干细胞等。
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考察期间，首先由NIBIO疾病生物资源部负责人Tohru Masui博士介绍了NIBIO的背景。随后，为使JCBR细胞库方面充分了解此次参观考察的目的，由考察团成员袁宝珠详细介绍了细胞室的现状和未来中国食品药品检定研究院细胞收藏及研究中心的发展规划。其后，在对JCRB细胞库主体进行实地参观前后，由细胞库具体负责人Kohara博士为考察团详细介绍了JCBR的历史和职能。在职能介绍中，Kohara博士重点介绍了JCRB所收藏的细胞种类、质量控制、细胞的应用、管理规范和相关的研究内容。
JCRB细胞库是由一个占地约1500平米的主体实验室部分，和一个约80平米的细胞储藏室组成。主体实验室设有细胞操作室(用于细胞培养、特殊处理、扩增、质量控制和细胞分装等)、分子生物学实验室、分子细胞遗传室、分子免疫学实验室、清洁室、储藏室等。从实地参观和交流中，考察团发现，虽然JCRB细胞库所收藏的细胞是以研究为目的，但整个细胞操作室的设计，在通风、空气过滤、内外缓冲间的设置和物品内外传送等方面，却基本体现了满足生产用细胞的有关清洁房间的原则。整个JCRB共有4个系统的清洁房间，其中装有9个用于细胞操作的生物安全柜。为避免所冻存的细胞在液氮罐中发生病原体污染的可能，JCRB细胞库均使用玻璃管冻存所有细胞。另外，洁净房间外安装了监控所有CO2细胞培养箱中，CO2浓度的自动报警装置。分子生物学实验室除进行常规细胞质控(如 DNA提取和STR指纹分析)外，主要从事与细胞质控相关的研究工作，包括DNA序列分析和基因组学分析，各种高通量基因阵列、microRNA阵列和SNP阵列等研究工作。分子细胞遗传室，除用于细胞质控相关的常规G-核型分析外，主要从事比较基因组学杂交(Comparative Genome Hybridization, CGH)和全染色体染色(SKY)技术支持的研究工作。参观过程中，负责SKY的工作人员为考察团展示了JCRB所完成的多个胚胎干细胞SKY图谱分析。分子免疫学实验室则是对所收藏的细胞，特别是干细胞，进行细胞表面标志物的流式细胞仪分析。另外，在多个实验室中，特别是清洁室和分子生物学室，都可看到数个从房顶垂下的电源供应线。这种电源供应线的设计虽不同于常规的设计惯例，但似乎能给新仪器设备的安装或临时使用(特别是数量较多时)提供便利。
JCRB细胞库的细胞储藏室，分四排整齐排列有20个大型液氮储藏罐(每个容积为430L，可保存至少12000只玻璃管)。除此以外，储藏室还存有数个用于细胞运输的小型液氮罐。由于细胞是以玻璃管的形式冻存的，所有细胞都可在液态的液氮中保存。每一液氮罐口的上方，都安置了照明灯，便于操作。储藏室为每一液氮罐安置了由计算机控制的、监控液氮水平的自动报警和液氮自动填充装置。液氮的供给是由位于整个研究所大楼的一个总液氮供应罐自动填充。而总液氮罐中液氮的填充，则是由当地的液氮供应商根据具体需要随时供应，或在一般情况下平均每周填充1次。细胞储藏室还设置了排放N2和及时监测储藏室内N2和O2浓度及报警的装置，以防在室内N2浓度太高而O2浓度太低的情况下，室内的操作人员发生窒息。参观后，考察团深刻地认识到了在设计、操作和管理等方面，代表当代研究用大型细胞资源中心的细胞储藏室所应具有的水平。
Kohara博士还为考察团详细介绍了JCRB细胞库的细胞管理和质控，及其相关的研究工作。管理上，细胞库对每一细胞，从引入(token stock，约12只)、扩增(seed stock，40只)到入罐及分发(Distribution stock，80-100只)分别给予临时编码(tentative number)、登记码(registry number)和JCRB码(JCRB number)，并对每一阶段的细胞进行质控检查。每一最后入罐的细胞，一般保持在每批100只左右的数量。这一细胞管理方式，与多层细胞库结构(two- or three-tiered structure)在概念上有些类似，但由于其所收藏的细胞是应用于研究为其主要目的，而非生产用或治疗用，因此并未采取严格的多层细胞库的结构和全面的质量控制测定。JCRB细胞库目前已收藏了近3000种人源性细胞株，并对所有这些细胞株进行了9个位点的STR图谱资料的采集，和对其中1000千多种细胞株完成了16个位点的STR图谱资料(即目前ATCC推荐的细胞鉴别方面的最高标准)的采集。在介绍细胞指控相关的研究内容方面，除上述提到的SKY、CGH分析、基因组学分析等较复杂的技术外，JCRB还与多个生物技术公司合作，开发了以PCR为主要方法，可同时初筛39个不同种系支原体污染的检测方法(MycoAlert，与Lonza公司合作)，可以同时对8个细胞株进行10个DNA病毒或10个RNA病毒的筛查方法，以及通过检测线粒体DNA中细胞色素B(Cytochrome B)基因来鉴别不同种系动物细胞来源。JCRB近年来也开始重视对各种干细胞的收藏，并成立了一专门的干细胞工作小组，主要负责人胚胎干细胞的收藏和质控分析工作。
JCRB细胞库拥有从事上述细胞收集、质控和相关研究所需的各种仪器设备，如流式细胞仪、DNA序列分析仪、SKY细胞核型分析仪等。此外，有些仪器设备则是采用与其它部门共享的机制。如JCRB目前正在开展的蛋白质组学研究所使用的质谱仪等，就是与其他部门共享的(该部门紧邻细胞储藏室，质谱仪等敏感性仪器被放置在100级洁净度的环境中)。整个JCRB细胞库考察结束后，主客双方就细胞库及细胞检定工作未来的合作，提出了许多初步的设想。
二、英国干细胞库
英国干细胞库是由英国国家生物制品标准研究所(NIBSC)细胞生物学和影像学部负责建设和管理的。此次访问由细胞生物室主任Glyn Stacey博士负责接待和安排的。Stacey博士是国际上知名度很高的细胞库方面的专家，也是积极推动多个细胞库和各种细胞产品质量控制相关研究国际合作的发起人和组织者。Stacey博士首先介绍了NIBSC的基本情况，再就英国干细胞库的基本职能、科研工作和国际交流与合作等方面做了初步介绍。袁宝珠主任做了有关中检院细胞室现状及未来发展规划的报告
NIBSC位于伦敦地区北部一个美丽平静的郊区，她在生物制品标准品研制方面处在国际领袖的地位。过去50年里，NIBSC生产出了超过95%的国际生物制品方面的标准品，并且是WHO在生物标准品研制方面重要的合作中心。经Stacey博士介绍，考察团了解到，NIBSC从事生物制品标准品的研制历史可以追溯到1925年。而英国干细胞库是于2003年，由英国政府通过Medical Research Council (MRC) 和Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC)两种资助途径建立的。建设全过程分3期，从2003-2014年，总投入约1500万英镑。其职能是收藏人源的干细胞株，主要是胚胎干细胞株(human Embryonic Stem Cells,hESC), 和少量诱导的全能干细胞株(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC)，并对收藏的细胞株进行性状分析和严格的质量控制检定，最终为在世界范围内提供符合研究用或临床用质量标准的干细胞株。
英国干细胞库在国际合作方面的一个重要内容就是，发起成立了国际干细胞联盟(International Stem Cell Forum， ISCF)。目前已有20多个国家的相关组织，以集资的方式加入了ISCF，以支持国际干细胞创意(International Stem Cell Initiative, ISCI)活动。ISCI活动的主要内容是，通过国际间共同努力，分析和研究尽可能多的hESC和iPSC。另外，ISCF还支持了国际干细胞库创意(International Stem Cell Banking Initiative，ISCBI)活动。ISCBI活动的主要内容是推动建立各hESC分发中心的对话机制，帮助建立新的细胞库，和促进干细胞储藏、检测和分发国际标准化工作。
随后，Stacey博士及其部门的4位高级研究员/课题组长(分别是Charles Hunter, Lyn Healy, Ross Hawkins和Roland Fleck博士)，为考察团就各自主管领域与细胞质控相关的管理及科研工作，进行了详细的介绍，并和考察团进行了深入细致的交流。Stacey博士介绍了细胞建库、质量控制和细胞培养中规范操作的基本原则;细胞培养中的风险评估和安全性检查。值得提出的是，英国干细胞库中细胞保藏的多级结构(每一种细胞从原始细胞，或修饰后的原始细胞，种子细胞，前主库细胞，主库细胞到工作库细胞，形成多层或多级保藏形式，并对每一层细胞进行相应的质量控制)与考察团有关细胞库的理念是一致的。而值得考察团认真学习的，是由Stacey博士起草的细胞培养规范(Good Cell Culture Practice, GCCP)中的理念。GCCP理念被引入到了2010版WHO动物细胞作为生产用细胞基质指导文件的草案中。其间，考察团就有关支原体污染的细胞问题，与Stacey博士讨论是否可保存经抗菌素清除的、曾经污染支原体的细胞。Stacey博士并不赞成此想法，并认为支原体感染对细胞的影响是多方面的和不可逆的，而杀支原体的抗菌素也可能会对细胞产生不可预料的作用。在涉及到干细胞在细胞培养中的特殊性方面，Stacey博士提出与目前干细胞治疗密切相关的问题，即要尽快建立用于干细胞质控的(特别是反映干细胞毒性)的检测方法和标准品。总之，Stacey博士为考察团带来的，是建立高质量干细胞乃至其他不同细胞库的先进理念和建库及管理经验。
Charles Hunter博士介绍了英国干细胞库全面复杂的管理框架和细胞库的常规运作和维护。从Hunter博士介绍中考察团了解到，英国从国家管理层面，对胚胎干细胞从胚胎收集、建立干细胞系到细胞治疗的研究和应用的不同阶段，已形成了多个法规性和非法规性的管理文件。在细胞库中干细胞储藏和使用方面，已形成了由干细胞库、生物制品监管部门、干细胞库监管委员会(Steering Committee)、和社会公众共同参与的，对干细胞株的来源及合理合法使用的有效监督机制。这种通过对干细胞的来源和使用的严格管理，直接有助于对以干细胞为主的细胞治疗的监管，非常值得借鉴。
Lyn Healy博士介绍了有关干细胞分析、细胞表面特异标志物、基因表达、分子细胞遗传学和干细胞分化全能性等方面的研究工作。Healy博士最近的一个重要工作，是与国际上多个研究室联合利用基因组学的方法，分析了50多种不同人源胚胎干细胞株，从中试图发现有效的、反映胚胎干细胞分化全能性的分子标志物，或标志物群。
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Ross Hawkins博士为我们介绍了各种现代“组学”(“omics”,包括基因组学, genomics,和蛋白质组学，proteomics)、表观遗传学等在干细胞检定研究中的应用。Hawkins博士也介绍了从转化细胞中，建立不同疾病基因诊断和用于评估治疗效果标准物质研发的工作。具体地，这类标准品的研发，首先需从不同类型疾病病人的外周血收集淋巴细胞，再用EB病毒高效转化这些淋巴细胞，使其在体外大量扩增，随后从扩增的细胞中提取DNA，并根据不同疾病的遗传背景或疾病在治疗过程中的遗传学改变，制成遗传特征特异的标准品，用于疾病的诊断或治疗效果的评估。目前，英国干细胞库已制成了用于诊断脆性X染色体综合征和其他疾病的标准品，并联合国际上多个研究室对其标准品进行合作标定。
Roland Fleck博士介绍了新的显微影像技术在干细胞分析和检定中的应用。其中包括，利用荧光共聚焦显微镜对胚胎干细胞体外分化成心肌细胞过程，实行实时成像，用于确定分化后的细胞具有心肌细胞规则性跳动的生理功能。这种方法目前正在国际上，被论证作为胚胎干细胞体外心肌分化的标准化检测方法之一，并具有发展成新的干细胞效应检测(potency assay)方法的可能性。
在进行繁忙的学术讨论和交流活动间隙，由Stacey博士本人或其同事，带领考察团实地参观了英国干细胞库专属区和相关研究室等。干细胞库专属区设在约1500平米的整个一层楼上，有5个洁净度为B级的洁净房间，和洁净度为C级的更衣室和干净走廊，2个R&D房间，一个细胞保藏室和一个耗材储藏室。除aCGH研究设备放置在B级洁净室，其余与质控研究相关的仪器设备，如影像学研究设备，均放置在干细胞专属区以外的研究室区。洁净房间的设计完全是按cGMP的要求设计的，即从清洁度D级缓冲间，到C级的更衣室和干净走廊，再到B级的洁净室和A级的位于洁净室内的生物安全柜。每个洁净房间都设计了与屋外人员通话(Intercom)和物品传送设施。细胞库总入口处设有对整个库区的各个部位，进行即时监控(包括对温度)的挂壁式平板电脑。细胞库专属区有紧急备份电源供应设备。总体而言，这种设计充分考虑到了与细胞培养方方面面的相关危险因素，对未来中国食品药品检定研究院细胞资源中心的设计和建设具有重要参考价值。
细胞保藏室是一个约60平米的房间，储藏有3个大的液氮罐(>400L/每个)，分别用于储藏研究级胚胎干细胞、临床应用级干细胞和细胞短暂隔离用。此外，保藏室还有多个小型液氮罐，用于大罐之间细胞的调配合细胞运输。与JCRB细胞库相同的是，所有液氮罐中的液氮，都由一放置于整个大楼外的总液氮罐自动填充。总液氮罐中液氮的供应则由当地液氮公司按需或每周一次地补充液氮。与JCRB细胞库不同的是，英国干细胞库现阶段的库存明显少的多，这可能与目前该库所收集的干细胞总量较少有关(目前总共收有100个hESC细胞株，其中10株为临床应用级的)，而且英国细胞库绝大多数是花在严格的质控和细胞库管理方面。但英国干细胞库在符合GMP的要求和质量认证上较JCRB水平高的多。为确保干细胞库洁净房间的洁净度始终达到相应的清洁要求，整个洁净室区每半年关闭停止使用然后严格清理一次。此外，英国干细胞库还与Thermo Fisher公司合作，在距NIBSC三十英里以外处，建立了相同规模和内容的备份用细胞保藏室。
英国干细胞库相关实验室包括细胞影像学实验室、分子细胞遗传室，和分子生物学实验室。影像学实验室设置有两套完整先进的透视电镜系统(包括标本制作部分，分别购自Hitachi和JEOL日本公司)，一套共聚焦显微镜(Leika公司)系统，数台高精度光学显微镜。应该说，英国干细胞库细胞影像学实验室的装备，代表了目前细胞影像学研究室的最高水平。
此外，双方还就干细胞治疗及其监管，以及双方未来的合作规划进行了细致的讨论。在干细胞治疗及监管方面，首先由袁宝珠介绍了中国干细胞治疗的现状，其中涉及到中国卫生部药监局，责成国内各干细胞治疗有关单位自查干细胞研究及治疗现状，中国食品药品检定研究院细胞室有关干细胞监管方面的一些考虑，和未来中国食品药品检定研究院细胞资源中心，在中国干细胞治疗监管中所应发挥的作用。在未来合作内容上，考察团就考察过程中所发现的，有利于双方共同发展的合作内容，逐个进行了讨论。在与Ross Hawkins博士相关内容中，双方谈到了就表观遗传学在干细胞和其它细胞检定方面的研究，以及协同标定来源于细胞的标准品，进行不断的沟通和合作。在与Roland Fleck博士相关的内容讨论中，考察团建议了在以细胞显微影像学技术为基础建立有效的干细胞生物活性检测方法方面，进行不断的沟通和合作。在与Charles Hunter博士相关的内容方面，考察团计划回国后进一步学习和消化已学习到的，有关英国在干细胞和干细胞治疗监管方面的经验和法规。最后考察团与Stacey博士就最近双方如何共同参与国际间有关干细胞治疗监管方面进行了交流和讨论，而这一讨论内容有其独特的重要意义，特别是在目前我国乃至整个世界范围尚未形成有效的、对干细胞治疗进行监管的形势下，尤为重要。
总之，此次参观考察收获巨大，充分达到了参观考察前所预设的各项考察目标。从这一考察中，考察团深刻地感受到了国内外在建立高质量国家级细胞资源中心方面，所存在的从细胞库设计、相关研究科室的配置、细胞质量控制、细胞库管理和国际化视野与合作等诸多方面所存在的显著差距。此次参观考察也使考察团对建设未来国家级细胞资源中心的思路越来越清晰。未来中国食品药品检定研究院的细胞资源保藏及研究中心，将会根据其特殊的职能定位，借鉴日本JCRB细胞库和英国干细胞库等国际高水平细胞资源中心的优点，成为有效服务于我国生物制品和药品研发，及进行各类细胞产品质量控制、干细胞治疗监管的国家级特殊资源中心，它也将成为在细胞产品和细胞治疗方面国际合作与交流的有效平台。
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