菌种是一个国家的重要自然资源 , 菌种保藏工 作是一项重要的微生物学基础工作 , 菌种保藏工作者的任务是把从自然界分离得到的野生型或经人工 选育得到的用于科学研究和工业生产等方面的优菌种 、 菌株 ,用各种适宜的方法妥善保存 , 使之达到 不死 、 、 不衰 不变异 、 不污染 ,在长时间内保持原有的生产性状和生命活力 ,以便于科学研究和生产使用 。
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1 微生物菌种保藏的基本原理
人们在长时间的工作实践中 , 根据微生物的不 无论何种保藏方法 ,主要是根据微生物生理 、 生化特同要求 ,在菌种保藏工作中不断摸索出各种方法 。
2保藏菌种用培养基
为了有效地保藏微生物菌种 , 首先需要有良好的培养基 。因此 , 研究选用适宜的培养基是微生物 菌种保藏最基本的工作 。例如 ,ATCC ( 美国的一个 微生物菌种保藏机构) 在 1970 年以前采用的培养基 有 498 种 ,1974 年有 724 种 ,1978 年达到 1006 种 ,平 均每年增加 60 多种 。
3 微生物菌种的保藏方法
将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上 , 待菌 充分生长后 ,棉塞部分用油纸包扎好 , 移至 4 ～ 6 ℃ 的冰箱中保藏 。 保藏时间依微生物的种类而有不同 ,霉菌 、 放线 菌及有芽孢的细菌保存 2～4 个月 ,移种一次 。酵母 菌两个月 ,细菌**每月移种一次 。斜面菌种应保 藏相继三代培养物以便对照 , 防止因意外和污染造 成损失 。 此法的培养时间和培养温度影响其保藏质量 。 培养时间过短 ,保存时容易死亡 , 培养时间长 , 生产 性能衰退 。一般以稍低于生长最适温度培养至菌种 成熟进行保藏 ,效果较好 [6 ] 。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法 , 优 点是操作简单 ,使用方便 , 不需特殊设备 , 能随时检 查所保藏的菌株是否死亡 、 变异与污染杂菌等 。缺 点是容易变异 ,因为培养基的物理 、 化学特性不是严 格恒定的 ,屡次传代会使微生物的代谢改变 ,而影响 微生物的性状 ; 污染杂菌的机会亦较多 。
3. 2 液体石蜡保藏法 亦称矿物油保藏法 , 定期移植保藏法的辅助方 法。 (1) 液体石蜡的准备 : 选用优质化学纯液体石 蜡 ,将液体石蜡分装加塞 , 用牛皮纸包好 , 采用以下 两种方式进行灭菌 : ①121 ℃湿热灭菌 30 min , 置 40 ℃ 恒温箱中蒸发水分 , 经无菌检查后备用 。 ② 160 ℃ 干热灭菌 2 h ,冷却后 ,经无菌检查后备用 。 (2) 斜面培养物的制备 : 将需要保藏的菌种 , 在 最适宜的斜面培养基中培养 , 使得到健壮的菌体或 孢子 。 (3) 灌注石蜡 : 用灭菌吸管吸取灭菌的液体石 蜡 ,注入已长好菌的斜面上 ,其用量以高出斜面顶端1 cm 为准 ,使菌种与空气隔绝 。 (4) 保藏 : 将试管直立 ,置低温 ( 4～6 ℃ 干燥处 ) 或室温下保存 ( 有的微生物在室温下比冰箱中保存保藏 2 年以上不死 , 酵母菌可保藏 1 ～ 2 年 , 一般无 芽孢细菌也可保藏 1 年左右 , 甚至用一般方法很难 保藏的脑膜炎球菌 , 在 37 ℃ 温箱内 , 亦可保藏 3 个 月之久 。此法的优点是制作简单 ,不需特殊设备 ,且 不需经常移种 。缺点是保存时必须直立放置 , 所占 位置较大 ,同时也不便携带 。从液体石蜡下面取培 养物移种后 ,接种环在火焰上烧灼时 ,培养物容易与 残留的液体石蜡一起飞溅 ,应特别注意 。 3.滤纸保藏法 (1) 将滤纸剪成 0. 5 cm × 2 cm 的小条 , 装入 1.0. 6 cm × cm 的安瓿管中 ,每管 1～2 张 ,塞以棉塞 , 8 121 ℃ 灭菌 30 min 。 ( 2) 需要保存的菌种 ,在适宜的斜面培养基上培养 ,使充分生长 。 ( 3) 灭菌脱脂牛乳 1 ～ 2 mL 滴加在灭菌培养皿 或试管内 ,取数环菌苔在牛乳内混匀 ,制成浓悬液 。 (4) 用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液 内 ,使其吸饱 ,再放回至安瓿管中 ,塞上棉塞 。 (5) 将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的 干燥器中 ,用真空泵抽气至干 。 (6) 将棉花塞入管内 , 用火焰熔封管口 , 保存于 低温下 。 (7) 需要使用菌种 , 复活培养时 , 可将安瓿管口 在火焰上烧热 ,滴一滴冷水在烧热的部位 ,使玻璃破 裂 ,再用镊子敲掉口端的玻璃 , 待安瓿管开启后 , 取 出滤纸 ,放入液体培养基内 ,置温箱中培养 。 细菌 、 酵母菌 、 丝状真菌均可用此法保藏 , 前两 者可保藏 2 年左右 , 有些丝状真菌甚至可保藏 14 ～ 17 年之久 。此法较液氮 、 冷冻干燥法简便 , 不需要 特殊设备 。
沙土保藏法 (1) 取河沙加入 10 %稀盐酸 , 加热煮沸 30 min ,以去除其中的有机质 。 ( 2) 倒去酸水 ,用自来水冲洗至中性 。 (3) 烘干 ,用 40 目筛子过筛 , 以去掉粗颗粒 , 备 用(4) 另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红的时间还要长 ) 。保藏时间 2 ～ 10 年 。保藏期间应 定期检查 ,如培养基露出液面 ,应及时补充无菌的液 体石蜡 。 (5) 恢复培养 : 恢复培养时 , 挑取少量菌体转接 在适宜的新鲜培养基上 ,生长繁殖后 ,再重新转接一 次。 此法实用而效果好 。霉菌 、 放线菌 、 芽孢细菌可土 ,加自来水浸泡洗涤数次 ,直至中性 。 (5) 烘干 ,碾碎 ,通过 100 目筛子过筛 , 以去除粗 颗粒 。 (6) 按一份黄土 、 三份沙的比例 ( 或根据需要而 用其他比例 , 甚至可全部用沙或全部用土 ) 掺合均 匀 ,装入 10 mm × mm 的小试管或安瓿管中 ,每管 100 装 1 g 左右 ,塞上棉塞 ,121 ℃ 湿热灭菌 30 min ,烘干。 ( 7) 进行无菌检查 ,每 10 支沙土管抽一支 ,将沙土倒入肉汤培养基中 ,37 ℃ 培养 48 h ,若仍有杂菌 , 则需全部重新灭菌 , 再作无菌试验 , 直至证明无菌 , 方可备用 。 (8) 选择培养成熟的 ( 一般指孢子层生长丰满 的 ,营养细胞用此法效果不好 ) 优良菌种 , 以无菌水 洗下 ,制成孢子悬液 。 (9) 每支沙土管中加入约 0. 5 mL ( 一般以刚刚 使沙土润湿为宜) 孢子悬液 ,以接种针拌匀 。 ( 10) 放入真空干燥器内 ,用真空泵抽干水分 ,抽 干时间越短越好 ,务使在 12 h 内抽干 。 (11) 每 10 支抽取一支 , 用接种环取出少数沙 粒 ,接种于斜面培养基上 , 进行培养 , 观察生长情况 和有无杂菌生长 , 如出现杂菌或菌落数很少或根本 不长 ,则说明制作的沙土管有问题 ,尚须进一步抽样 检查 。 ( 12) 若经检查没有问题 ,用火焰熔封管口 ,放冰 箱或室内干燥处保存 。每半年检查一次活力和杂菌 情况 。 ( 13) 需要使用菌种 ,复活培养时 ,取沙土少许移 入液体培养基内 ,置温箱中培养 。 此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌 、 放线 菌 ,因此在抗生素工业生产中应用最广 , 效果亦好 , 可保存 2 年左右 ,但应用于营养细胞效果不佳 。
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以上各法可根据实验室具体条件与需要选用 , **是每株菌种都采用两种以上的保藏方法 , 并根 据保藏菌种的保质期 ,每隔一定时间 ,进行入藏菌种 的复活检验和更新
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